詳談貴州鳳崗綠茶對小鼠抗氧化抗衰老的作用論文
貴州為我國綠茶的主要省份，而鳳岡產茶歷史悠久。唐代茶圣陸羽在他撰寫的世界第一部茶書《茶經》八之出中記述:“黔中生思州、播州、費州、夷州……，往往得之，其味極佳”。據考證，夷州治所就是今鳳岡縣綏陽鎮(zhèn)。宋代《華陽國志》中“平夷產茶蜜”，樂史《太平寰宇記》“夷州、播州、思州以茶為貢”和清代《梅移隨筆》“龍泉產云霧芽茶，色味雙絕”中的夷州、思州、龍泉都是指今鳳岡一帶。最新科學研究表明，富鋅富硒綠茶中所含有的天然物質成分對防衰老、防癌、抗癌、殺菌、消炎等均有特殊效果，為其他茶類所不及。筆者通過測定肝臟組織中SOD 和GSH-Px 的mRNA 及其蛋白質表達水平，研究富鋅富硒綠茶對D-半乳糖誘導的亞急性衰老小鼠的抗氧化、抗衰老作用，為貴州特色茶葉產業(yè)的發(fā)展和推廣提供營養(yǎng)保健的基礎數據。
1 材料與方法
1. 1 試驗材料和儀器
1. 1. 1 動物。昆明雄性小鼠70 只，體重(18 ～ 25 g)，購自貴陽醫(yī)學院動物中心(合格證:10000S38)。
1. 1. 2 藥物。供試富硒富鋅綠茶由貴州鳳岡縣永安鎮(zhèn)田壩村所產，2013 年春季采摘。經貴州省山地研究所測試中心測定，該綠茶含鋅、硒含量分別是65. 47 ± 0. 02、1. 74 ± 0. 02 mg /kg。按茶水比為2 g∶20 ml 的比例，用沸水沖泡30 min 制成茶水，過濾，為高濃度組;稀釋1 倍過濾后為中濃度組;再量取等體積水稀釋，過濾后為低濃度組;普通綠茶泡制方法同前;維生素C 片劑，用濃度0. 9% 生理鹽水配制成50 g /ml溶液。
1. 1. 3 試劑。D-半乳糖由上海恒信化學試劑廠生產;動物組織總RNA 提取試劑盒(天根，批號DP121221);Thermo 試劑盒(Fermentas 公司);6 × DNA 電泳Loading Buffer 上樣液(天根，批號BC110413);溴化乙錠(EB) 溶液( 天根，批號BC120227);DNA marker(北京康為世紀生物科技有限公司生產，批號CW0632);濃度30%丙烯酰胺(賽蘭博，批號8080);1. 5 mol /L Tris(pH 8. 8);1. 0 mol /L Tris(pH 6. 8);濃度10%SDS;濃度10%過硫酸胺(APS);TEMED;BAC 法蛋白定量試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司);兔抗小鼠SOD-1 多克隆抗體(Santa Cruz 公司，批號sc-11407);兔抗小鼠GSH-1 多克隆抗體(Santa Cruz 公司，批號sc-292189);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(Santa Cruz 公司，批號sc-2004)。
1. 1. 4 儀器。凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad 公司)，酶標儀(美國Bio-Tek 公司)，電泳儀( 美國Bio-Rad 公司)，3k15高速冷凍離心機(德國Sigma 公司)，T148 050-900 型PCR 儀(德國Biometra 公司)，水平電泳儀( 美國伯樂BIO-RAD 公司)，Dolphin-Doc 凝膠成像系統(tǒng)和Dolphin-ID 軟件( 美國Wealtec 公司)，高壓滅菌鍋(日本三洋公司)，MP200A 型電__子天平(上海良平儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)，Morris 水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物所)，動物運動軌跡記錄分析系統(tǒng)(普升科技有限公司)，HPLAS-2000 計算機圖像分析系統(tǒng)(無憾千屏公司)。
1. 2 試驗方法
1. 2. 1 動物衰老模型的構建。用濃度75% 乙醇消毒小鼠下腹部，用D-半乳糖(0. 2 mg /g 小鼠體重)腹腔注射，連續(xù)14d，誘發(fā)衰老模型，之后連續(xù)28 d 每日給予相同劑量以維持衰老模型。空白組小鼠注射濃度0. 9% 生理鹽水(0. 1ml /10 g小鼠體重)，給藥方法同模型組。
1. 2. 2 行為學測試(游泳水迷宮試驗)。在連續(xù)灌胃21 d后，采用環(huán)形水池。水池中放一低于水面1 cm 左右的逃避平臺。模型小鼠預先訓練4 d，每次取1、2、3、4 四個象限入水點背對站臺放入水池。若小鼠在60 s 內找到平臺，則使其停留15 s;若60 s 內未找到平臺，則將其誘導到平臺上，并停留15 s 方結束一次訓練。連續(xù)訓練4 d，在第5 天進行行為學測試，其檢測指標有:①定向航行試驗，測定每只小鼠從放入水中開始到跳到逃避平臺時的時間，即逃避潛伏期;②空間探索試驗，測定每只小鼠穿越平臺區(qū)所用時間及穿越站臺次數。
1. 2. 3 分組與給藥。小鼠分為空白組、衰老模型組、普通綠茶組、富鋅富硒綠茶(高、中、低劑量)組、陽性對照組(維生素C 片)，每組10 只小鼠。給藥方案為:給予D-半乳糖(0. 2mg /g)14 d 后，普通綠茶組給予普通綠茶茶水灌胃;富鋅富硒綠茶組按照高、中、低濃度進行灌胃;模型組、空白組給予等容積蒸餾水灌胃;陽性對照組灌胃1 g /L 維生素C 溶液，1次/d，連續(xù)給藥28 d。
1. 2. 4 小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px 蛋白質表達水平的檢測。提取肝臟組織總蛋白，取少量上清液進行蛋白定量，余下- 20℃保存?zhèn)溆茫颇z，然后取20 μl 蛋白質樣品加上樣緩沖液，煮沸變性后進行SDS-PAGE 電泳;電轉移至PVDF 膜;用含濃度5%脫脂奶粉的TBST 振蕩封閉2 h;分別加入適量一抗4 ℃封閉過夜，次日以TBS-T 洗膜3 次，每次10 min;加二抗，室溫振搖孵育2 h;洗膜后ECL 法顯影。以β-actin 為內參，條帶經Kodok Digital Science ID Image Analysis Software 及GDS-1 數字化凝膠成像分析儀掃描，計算吸光度(A)。A 比值= 目的蛋白A/β-actinA式中，A 比值為目的蛋白表達量的相對含量。試驗重復3 次，取平均值。
1. 2. 5 小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px mRNA 表達水平的檢測。用動物組織總RNA 提取試劑盒提取小鼠肝臟組織總RNA，提取后取5 μl RNA 對RNA 純度、濃度進行檢測(提取方法嚴格按照說明書進行)。RT-PCR 引物設計依據昆明小鼠中的SOD 和GSH-PxmRNA 序列和β-actin mRNA 序列設計，經blast 進行特異性確定。最后，由上海生物工程技術服務有限公司合成引物。SOD mRNA 上游引物:5’-CTGTACCAGTGCAGGACCTCAT-3’，下游引物:5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCTT-3’。該引物擴增的片段長度為221 bp。GSH-Px mRNA 上游引物:5’-GAAGTGCGAAGTGAATGGTGAGA-3’，下游引物:5’-AGTTGCCAGACTGCTGGGACA-3’。該引物擴增的片段長度為269bp。β-actin mRNA 上游引物: 5’-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3’，下游引物: 5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。該引物擴增的片段長度為541 bp。將提取的RNA 逆轉錄(RT-PCR) 成cDNA，方法參考Fermentas 公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書。然后，以cDNA 為模板，以SOD、GSH-Px 和β-actin 引物分別進行PCR 反應。PCR 反應體系為:ddH2O 6 μl，2 ×Taq PCR MasterMix 13 μl，上下引物各1 μl，上下內參各1 μl，模板2 μl。PCR 擴增反應條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。產物在PCR 反應結束后電泳，結果掃描保存。1. 2. 6 統(tǒng)計學處理。數據采用SPSS 17. 0 系統(tǒng)軟件進行處理。計量資料采用單因素方差分析和多重比較，P < 0. 05 差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果與分析
2. 1 小鼠衰老模型驗證
2. 1. 1 小鼠外觀。研究表明，空白組小鼠體質量正常增加;模型組小鼠從造模第28 天開始，體重增加速度下降，部分毛發(fā)脫落、失去光澤，出現(xiàn)行動遲緩、精神萎靡不振等癥狀;富鋅富硒綠茶高劑量組小鼠精神狀態(tài)好于普通綠茶組;富鋅富硒綠茶中劑量組小鼠精神一直良好，毛發(fā)光滑整齊，體重增長速度正常;富鋅富硒綠茶低劑量組小鼠精神狀態(tài)略好于高劑量組小鼠;普通綠茶組小鼠表現(xiàn)與空白組相似;陽性組小鼠表現(xiàn)與中劑量組相似。
2. 1. 2 小鼠血清驗證。通過對比模型組與空白對照組，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中MDA 含量在0. 05 水平顯著升高，而血清中SOD 活力、GSH-Px 活力、過氧化氫酶(CAT) 活力顯著降低。
2. 1. 3 行為學測試結果。由表1 可知，在定向航行試驗中，與空白組相比，模型小鼠所用的逃避潛伏期較長(P < 0. 01);普通綠茶組所用的逃避時間與空白組相差不大(P > 0. 05);與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組所用的逃避潛伏期較短(P < 0. 01);與陽性對照組相比，富鋅富硒綠茶中劑量組所用的逃避潛伏期與之相當(P > 0. 05);與模型組相比，富鋅富硒綠茶組所用的逃避潛伏期明顯縮短(P < 0. 01)。在空間探索試驗中，與空白組相比，模型組第1 次穿越平臺區(qū)所用時間延長，穿越站臺次數明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義( P<0. 1="" p="">0. 05); 與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組第1 次穿越平臺區(qū)所用時間縮短，穿越站臺次數增多，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 01);與陽性對照組相比，富鋅富硒綠茶中劑量組第1 次穿越平臺區(qū)所用時間和穿越站臺次數與之相差不大(P > 0. 05);與模型組相比，富鋅富硒綠茶組第1 次穿越平臺區(qū)所用時間縮短，穿越站臺次數明顯增多(P < 0. 01)。
2. 2 富鋅富硒綠茶對衰老模型小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px蛋白質表達水平的影響
模型組蛋白表達低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 01);富鋅富硒綠茶高、中、低劑量組蛋白表達高于衰老模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 01);富鋅富硒綠茶高劑量組蛋白表達低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05);富鋅富硒綠茶中劑量組蛋白表達高于高、低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05);富鋅富硒綠茶組蛋白表達高于普通綠茶組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 01)。
2. 3 富鋅富硒綠茶對衰老模型小鼠肝臟組織SOD、GSH-PxmRNA 表達水平的影響
模型組mRNA 表達低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 01);高、中、低劑量組mRNA 表達高于衰老模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0. 01);高劑量組mRNA 表達低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05);中劑量組mRNA 表達高于高、低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05);富鋅富硒綠茶組mRNA 表達高于普通綠茶組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 01)。
3 討論
富鋅富硒綠茶中含有鋅和硒2 種微量元素。鋅元素是生物體內重要的抗氧化酶超氧化物歧化酶的輔基;硒元素是谷胱甘肽過氧化物酶的必需成分，每摩爾GSH-Px 含有4 g 硒原子。因此，富鋅富硒綠茶可以為機體抗氧化物質提供豐富的原材料。
研究表明，SOD 和GSH-Px 是機體抗氧化系統(tǒng)中2 種重要的抗氧化酶。其中，SOD 對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，能夠有效清除自由基，減輕脂質過氧化，保護細胞免受損傷。趙會杰等通過D-半乳糖所致衰老小鼠飼喂SOD 蘋果，發(fā)現(xiàn)可顯著提高小鼠血清和肝臟組織的SOD、CAT 和GSH-Px 活性，抑制脂質過氧化，降低MDA 含量。GSH-Px 則是機體內重要的分解過氧化物的含硒酶。GSH-Px 的酶活力可以作為衡量機體硒抗氧化的能力。在體內，SOD 將超氧自由基O2- 轉化為H2O2，GSH-Px 進一步將H2O2轉化為H2O 和O2，并且通過減少過氧化物對SOD 的損害增加SOD 的活性。SOD 和GSH-Px 兩者之間明顯存在著相互保護作用和協(xié)同抗氧化作用。還有研究通過測定SOD 活性，推測其改善學習記憶作用可能與其提高體內SOD活性有關，其活力間接反映機體保護細胞免受損傷的.抗氧化能力。
研究中，通過皮下注射D-半乳糖，在體內代謝過程中產生過量的超氧陰離子自由基O2- 和H2O2，引起代謝紊亂，進而提高體內自由基水平及過氧化體內組織制造和自然衰老類似的亞急性衰老模型。同時，以此為模型，研究貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對小鼠的抗氧化作用。通過觀察小鼠外觀、血清學試驗和行為學測試結果，發(fā)現(xiàn)造模成功。在小鼠行為學測試中，發(fā)現(xiàn)富鋅富硒綠茶中劑量組的抗氧化作用最佳，提高小鼠的學習能力，延緩小鼠的衰老。
該試驗結果進一步表明，富鋅富硒綠茶可明顯提高D-半乳糖所致衰老小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px mRNA 和蛋白質表達水平。富鋅富硒綠茶可通過改變SOD、GSH-Px 的mRNA和蛋白質表達，導致小鼠肝臟和血清中SOD、GSH-Px 含量增加，提高酶活力，在一定程度上增加抗氧化的能力，減慢細胞衰老的速度，達到改善衰老的作用。抗氧化生化指標與水迷宮空間記憶能力試驗中定向航行和空間探索試驗結果相一致。另外，研究表明，中濃度富鋅富硒綠茶劑量抗氧化效果更佳，原因還有待進一步研究。總之，貴州鳳岡富鋅富硒綠茶具有清除自由基、抗氧化等作用，改善衰老的行為學特征，延緩衰老的進程。
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