鋅依賴的金屬蛋白酶1對巨噬細胞凋亡的促進作用論文
結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的以呼吸道病變為主的一種慢性的傳染病。據世界衛生組織最新統計，僅2013年約900萬例新發結核病病例，約150萬人死亡。卡介苗(BacillusCalmetteGuerinvaccine，BCG)是使用最廣泛、最安全的預防結核病的唯一疫苗，但它在不同地區和接種人群中免疫效果不穩定，為0%～80%不等，其具體的機制不明。鋅依賴的金屬蛋白酶1(zinc-dependentmetalloprotease1，Zmp1)是MTB的一種毒力因子。Zmp1與MTB的致病關系密切，可影響吞噬體與溶酶體的融合而使MTB逃避免疫清除。巨噬細胞是MTB感染與免疫形成的關鍵細胞，巨噬細胞的凋亡在機體抵抗病原菌的感染有重要作用。BCG中的Zmp1對巨噬細胞的增殖凋亡有無影響目前尚無相關文獻報道。本研究旨在構建BCG的zmp1基因含增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的真核表達質粒pEGFPN1-zmp1，并轉染RAW264.7巨噬細胞，觀察zmp1基因表達產物對巨噬細胞凋亡的影響。為進一步明確Zmp1對巨噬細胞的作用、Zmp1對免疫功能的影響奠定基礎。
1材料和方法
1.1材料
pEGFP-N1質粒、Top10菌株、BCG菌株(丹麥株)均由重慶醫科大學分子醫學與腫瘤研究中心實驗室保存;RAW264.7細胞由重慶醫科大學生命科學研究院惠贈;500bpDNAladder購自北京天根生化科技有限公司;限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ均購自大連寶生物工程有限公司;1×高糖DMEM、2.5g/L胰蛋白酶溶液、胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)均購自Hyclone公司、LipofectamineTM2000Reagent均購自Invitrogen公司。藻紅蛋白標記的膜聯素Ⅴ/7-氨基放線菌素D(annexinⅤ-phycoerythrin/7-amino-actinomycin，annexinⅤ-PE/7-AAD)雙染色試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.1引物設計及合成根據GenBank登錄的zmp1基因序列(NP_214712.1)，以真核表達質粒pEGFP-N1為框架設計2條zmp1基因PCR擴增引物并添加酶切位點，上、下游引物序列分別如下(酶切位點為波浪線部分):P1:5'-AAACTCGAGGCCACCATGGTGACACTTGCCATCCCC-3';P2:5'-AAAGGATCCGTTCCAGATCCGG-3';P1設計限制性內切酶XhoⅠ酶切位點，同時引入Kozak序列(劃線部分)和起始密碼子(ATG);P2設計限制性內切酶BamHⅠ酶切位點，同時刪除zmp1基因C端的終止密碼子，引物交由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。
1.2.2構建真核表達質粒pEGFP-N1-zmp1BCG菌全基因組DNA為模板，PCR法擴增zmp1基因片段，反應體系50μL:5×高保真酶緩沖液10μL，高保真酶1μL，BCG菌全基因組DNA1μL，dNTP混合物4μL，引物P1和P2各1μL，滅菌雙蒸水32μL。反應條件:95℃預變性10min，(95℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min)×32個循環;72℃延伸10min;反應產物16℃降溫5min。經10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，按照試劑盒說明書進行回收純化大小約2000bp的特異性PCR產物。PCR產物和pEGFP-N1質粒經XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收純化zmp1片段和質粒片段;連接質粒片段與zmp1基因片段連接反應體系(20.0μL):10×T4緩沖液2.0μL、T4DNA連接酶1.0μL、pEGFP-N1質粒片段1.0μL、zmp1基因雙酶切產物10.0μL、滅菌雙蒸水6.0μL、4℃連接12h。將連接產物轉入E.coliTop10感受態細胞中，用LB(含卡那霉素20μg/mL)平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落接種到5mLLB(含卡那霉素20μg/mL)液體培養基中，37℃培養12～14h，提取質粒。
1.2.3重組質粒鑒定菌落PCR法篩選鑒定陽性克隆，以挑單菌落的菌液為模板克隆zmp1基因;10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，分析結果。提取陽性克隆菌質粒酶切鑒定，經XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定，酶切反應產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結果。對雙酶切鑒定正確的重組質粒進行核酸DNA雙向測序鑒定。
1.2.4重組質粒在RAW264.7細胞中表達將核酸測序正確的重組質粒用脂質體LipofectamineTM2000轉染RAW264.7細胞，37℃恒溫50mL/LCO2靜置培養，同時以pEGFP-N1質粒轉染RAW264.7細胞作為對照組。轉染后24h，熒光倒置顯微鏡觀察熒光表達。
1.2.5實時熒光定量PCR檢測zmp1mRNA表達水平質粒pEGFP-N1-zmp1轉染RAW264.7細胞48h后，根據RNA提取試劑盒說明書提取RAW264.7細胞總RNA;按照TaKaRaPrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit說明書逆轉錄合成cDNA。實時熒光定量PCR擴增zmp1基因上、下游引物(P3、P4)和β-actin上、下游引物(P5、P6)。P3為5'-ACGGGGGCGAGAGCCGTGAC-3'，P4為5'-CCAGTCTTCAACGTTAACGC-3';P5為5'-AACTCCATCATGAAGTGTGAC-3'，P6為5'-TAACGCAACTAAGTCATAGTC-3'。實時熒光定量PCR反應體系(15.0μL):SYBRK7.5μL、P3/P50.3μL、P4/P60.3μL、cDNA3.0μL、滅菌雙蒸水6.6μL;95℃5min、95℃10s、60℃15s、72℃20s，循環39次;72℃延伸6min。
1.2.6流式細胞術檢測Zmp1蛋白對巨噬細胞凋亡影響實驗分為3組，空白組(未轉染質粒組)、轉染pEGFP-N1質粒組(空質粒對照組)、轉染pEGFP-N1-zmp1質粒組(實驗組);轉染后48h，用不含EDTA的2.5g/L胰蛋白酶消化收集細胞，室溫下1500r/min離心5min，棄上清;適量PBS洗滌細胞2～3次;以1×結合緩沖液調整細胞數為1×106個/mL;取100μL細胞懸液于5mL流式管中，加入5μLannexinⅤ-PE和10μL7-AAD，輕輕混勻;避光、室溫反應15min;加入400μL1×結合緩沖液，混勻，流式細胞術檢測，每組實驗分別獨立重復3次。
2結果
2.1zmp1基因片段的擴增和鑒定
分別以BCG基因組和重組質粒為模板，PCR擴增zmp1基因片段，PCR產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，在2000bp左右出現特異性條帶，條帶大小與預期值相同。重組質粒pEGFP-N1-zmp1經XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，分別得到大小約4700bp和2000bp的條帶。重組質粒DNA測序結果與GenBank登錄的MTB中zmp1(NP_214712.1)基因序列比對顯示完全相同，提示zmp1成功插入pEGFP-N1質粒中。
2.2zmp1mRNA在巨噬細胞中的表達和鑒定
轉染后48h，提取細胞總RNA并通過逆轉錄反應合成cDNA，以cDNA作為模板和β-actin作為內參檢測zmp1的表達。結果顯示，僅pEGFP-N1-zmp1轉染組檢測到zmp1mRNA表達，pEGFP-N1轉染組和空白對照組(未轉染)均未檢測到zmp1mRNA表達。
2.3各組RAW264.7細胞凋亡檢測
流式細胞術檢測細胞凋亡數據分析顯示，轉染后48h，實驗組與空白組和對照組比較，早期凋亡率和壞死率有所增高，存活率有所下降，差異有統計學意義(P<0.05)。
3討論
巨噬細胞既是分枝桿菌感染的宿主細胞，又是一種抗感染的免疫細胞，它的正常功能狀態直接影響到分枝桿菌在細胞內的轉歸和結局。巨噬細胞凋亡在分枝桿菌感染的過程中是一種常發事件，現有的研究發現，分枝桿菌的多種分子可通過調節巨噬細胞的凋亡影響巨噬細胞的功能。一般認為，分枝桿菌感染后，誘導巨噬細胞的凋亡，通過形成凋亡小體，被活化的吞噬細胞吞噬消化有利于分枝桿菌的清除，這對于菌體抵抗分枝桿菌的感染有著重要作用。而有些致病力比較強的.分枝桿菌，如MTB則通過它表達的分子抑制巨噬細胞凋亡過程，達到逃避免疫殺傷、潛伏的目的。相反，毒力弱的分枝桿菌如H37Ra、BCG等則常常促進巨噬細胞的凋亡。
Zmp1由MTB的Rv0198c基因編碼，它是分枝桿菌的重要毒力分子，刪除zmp1基因的BCG對動物的免疫保護性增強。它可通過抑制caspase-1激活，抑制炎性復合體激活和炎性趨化因子白細胞介素1β(interleukin1β，IL-1β)分泌，阻止吞噬體活化成熟，進而阻止吞噬溶酶體的結合和融合，影響后續的殺菌過程及特異性抗MTB免疫的激發。但它對巨噬細胞的增殖、凋亡的影響，尤其是巨噬細胞凋亡的影響還未見相關的報道。
因此，本實驗設計重組的Zmp1胞內表達來觀察該分子是否對巨噬細胞的凋亡是否產生影響，以利于后續的功能研究。實驗中我們選用的RAW264.7巨噬細胞，生長旺盛能連續穩定分裂增殖，是研究巨噬細功能的常用細胞株。同時構建的質粒會表達綠色熒光蛋白，有利于我們的對蛋白表達的觀察。流式細胞術是檢測細胞凋亡的常用方法，我們采用annexinⅤ-PE和7-AAD來標記Zmp1作用的巨噬細胞，通過流式細胞術來檢測細胞凋亡可了解Zmp1蛋白對細胞凋亡的影響。結果顯示，重組蛋白Zmp1胞內表達可引起巨噬細胞早期凋亡率增高，這與Aguiló等的研究結論類似。本研究的結果為進一步研究Zmp1蛋白通過何種機制導致巨噬細胞凋亡，對巨噬細胞的免疫功能產生何種影響的研究奠定了基礎。
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