討論基于腎陽虛證候研究制首烏對肝細胞的影響論文
近年來，我國藥物性肝損害的發生率呈不斷上升的趨勢，據統計，我國由藥物導致肝損傷患者占急性肝炎患者的10%。其中，因使用中草藥而產生的肝損害甚至中毒致死的臨床報道也呈逐年上升趨勢。持續高發的中藥肝損害事件成為醫患糾紛的重要因素之一，同時也對中藥安全低毒的傳統認知和優勢構成了巨大的挑戰，給中醫藥的進一步發展、普及應用蒙上了陰影。一些傳統并不認為具有毒性的中藥，如何首烏(Polygonum multifl orum Thunb.)，陸續出現中毒致肝損傷的報道。何首烏經過炮制后具有補益精血、固腎烏須之功，為傳統滋補腎陰的代表性藥物之一，雖已發現其所含的蒽醌類、鞣質等均有一定的肝毒性，但該藥物在臨床中用于治療腎陰虛證已有千余年，卻未有肝損傷的報道。因此，筆者推測目前臨床中制首烏導致肝損傷的發生可能與未按辨證論治原則使用藥物，即藥不對證有關。本文以中醫證候為基礎，探討腎陽虛大鼠的制首烏含藥血清對L02肝細胞的影響。
材料
1. 細胞系及培養條件
人正常肝細胞株L02，購自湘雅中心實驗室細胞庫，在含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基，37℃，5%CO2及飽和濕度條件下進行常規培養，所有試驗均在細胞對數生長期進行。
2 . 藥品與試劑
R PMI-16 4 0完全培養基、胎牛血清、胰蛋白酶，購自美國Gi b co公司;噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)，購自美國Sigma公司;Annexin V-FITI/PI細胞凋亡檢測試劑盒，購自南京凱基生物科技發展有限公司，批號：20140630;何首烏藥材，購自四川成都荷花池藥材市場，批號：1209341405。
3. 動物
SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體質量(200±20)g，3月齡，購自西安交通大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(陜)2012-003，飼養于陜西中醫藥大學實驗動物中心。飼養環境保持室溫20-25℃，相對濕度40%-60%，實驗動物自由進食和飲水。
4. 儀器
Cell Lab流式細胞儀，美國貝克曼公司;AE-21倒置顯微鏡，麥克奧迪公司;CB-150二氧化碳培養箱，德國Binder公司;DHG-9075 A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司;TGL-16G高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;EX-8080酶標儀，美國BIO-TEK公司;TS100-F倒置熒光數碼顯微鏡，日本Nikon公司。
方法
1. 制首烏藥材及水煎液的制備
將生何首烏按照2010年版《中華人民共和國藥典》方法(清蒸法)進行炮制，隨后將制首烏分別按照高、中、低濃度進行煎煮。煎煮方法為：將制首烏置于煎煮容器中，加入相當于藥材量5倍的冷水浸泡60min，煮沸30min，再加入相當于藥材量3倍的冷水繼續煎煮，20min后，煎煮液濃縮。
2. 制首烏含藥血清的制備
SD大鼠40只，隨機分為4組，每組10只。其中，3組大鼠皮下注射氫化考的松，每日1次，25mg/kg，連續14d，造成腎陽虛證模型[9]，另1組為生理鹽水組。隨后各組分別以高(43.2g/kg)、中(21.6g/kg)、低濃度(10.8g/kg)的制首烏水煎液及0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天給藥2次，連續7d，末次給藥1h后乙醚麻醉大鼠，無菌條件下心臟取血，立即注入無菌管里，室溫靜置，待血液凝固，血清析出后，吸取上清液離心，3 000r/min，10min后再吸取上清液，即得制首烏含藥血清。血清混合后，置于56℃水浴中滅活30min，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。經培養實驗證實無微生物污染后，置于-20℃冰箱中保存備用。
3. MTT法測定肝細胞線粒體功能
將細胞接種于培養瓶中，加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培養基5mL，置37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養箱中培養，鏡下觀察細胞貼壁生長情況。取生長狀態良好的同一批傳代細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用10%FBS的RPME-1640培養液將細胞重懸，以每孔103-104個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積為100μL，繼續培養24h，使細胞同步化。各組分別加入高、中、低濃度的制首烏含藥血清及正常大鼠血清(終濃度為15%)，每組6個復孔，設只加培養基的調零孔3個。置37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養箱中培養24、48h。每孔加入MTT溶液(5g/L，用PBS配制，pH=7.4)10μL。繼續在37℃、5%CO2培養箱內培養4h，小心地將每孔的.培養液吸出，加入DMSO150μL，在搖床上中速搖勻10min。酶標儀490nm波長，檢測各孔光吸收值(A)。
4. 流式細胞術(flow cytometry，FCM)測定
肝細胞凋亡率 取生長狀態良好的同一批傳代細胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，用含10%FBS的RPMI-1640培養液重懸，以2×104/mL，每孔2mL接種于6孔培養板中，繼續培養24h，使細胞同步化。各組分別加入15%高、中、低濃度的制首烏含藥血清培養48h，生理鹽水組以生理鹽水組大鼠血清代替，更換新的10%FBS+MEM培養液200μL。細胞經處理到所需時間后，收集細胞，用預冷的PBS洗3次后，應用AnnexinV-PI雙標試劑盒，按照試劑盒說明書要求，采用FCM及熒光顯微鏡分別檢測和觀察細胞凋亡情況。用流式細胞儀計數位于凋亡區內的細胞數量得到凋亡細胞百分率。
5. Annexin V-FITC/PI雙染色熒光顯微鏡觀察
L02肝細胞凋亡狀態 取生長狀態良好的同一批傳代細胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，用含10%FBS的RPMI-1640培養液重懸，接種于含蓋玻片的6孔培養板中，各組分別加入15%高、中、低濃度的__制首烏含藥血清培養48h，生理鹽水組以生理鹽水組大鼠血清代替。用PBS洗滌細胞2次，在50 0μL的Binding Buffer中加入5μL Annexin V-FITC，5μLPropidium Iodide，混勻后滴加于蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋。避光、室溫反應5min。將蓋玻片倒置于載玻片上，用熒光顯微鏡、雙色濾光片觀察。
6. 統計學方法
數據統計采用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料以x-±s表示，單因素方差分析(One-way ANOVA)比較多組間的差異性，以P<0.05為差異有統計學意義。
結果
1.制首烏含藥血清對L 0 2肝細胞增殖的影響
見圖1。與生理鹽水組相比，15%腎陽虛各濃度組含藥血清作用24h及48h后，均對L02肝細胞增殖有一定的抑制作用，其中，腎陽虛中、高濃度組含藥血清作用48h后對L02肝細胞增殖的抑制率分別為15.23%、24.92%，與生理鹽水組比較，差異顯著(P<0.05，P<0.01)。
2. 制首烏含藥血清對L02肝細胞凋亡率的影響
收集經制首烏含藥血清處理后的L02肝細胞，用Annexin V-PI雙標試劑盒，進行AV/PI雙染后用流式細胞儀檢測L02肝細胞的凋亡率。結果判定標準：Annexin V-/PI-為正常細胞，Annexin V+/PI-為早期凋亡細胞，Annexin V+/PI+為晚期凋亡細胞或壞死細胞，Annexin V-/PI+為細胞膜機械損傷的細胞。實驗結果表明，各組均出現不同程度的細胞凋亡，凋亡細胞多為晚期凋亡細胞或壞死細胞。與生理鹽水組相比，腎陽虛各濃度組細胞凋亡率均出現明顯升高，其中，腎陽虛中、高濃度組細胞凋亡率與生理鹽水組比較，差異顯著(P<0.01)。
3. 制首烏含藥血清對L02肝細胞凋亡熒光染色的影響
雙染后，正常細胞無熒光;細胞膜綠色熒光為早期凋亡細胞，細胞膜綠色熒光而細胞核紅色熒光為晚期凋亡細胞，紅色熒光為壞死細胞。生理鹽水組中凋亡細胞較少，腎陽虛大鼠制首烏含藥血清給藥后，其中，腎陽虛中、高濃度組出現早期凋亡及晚期凋亡的細胞較多。
討論
中醫傳統理論認為，中藥的毒性是其治療作用的基礎。《景岳全書·類經》云：“藥以治病，因毒為能，所謂毒者，因氣味之有偏也??所以去人之邪氣”�！饵S帝內經》中記載有“有故無殞”之說，明代醫家張景岳解釋道：“大積大聚之故，有是故而用是藥，所謂有病則病受之??非用毒藥不能攻，攻亦無害，故可犯也”。明確提出了“有病則病受之”的觀點，提示在認識中藥時不應孤立地去研究藥物本身，而應該著眼于藥物與機體的相互關系。當機體有邪氣時，藥物作用于病邪，表現出的是治療作用，而當藥物作用于正常機體時，所謂偏性(毒性)就有可能作用于機體本身，因此，本文在建立腎陽虛大鼠模型的基礎上，來研究制首烏含藥血清對L02肝細胞的影響。
本課題采用對大鼠注射氫化考的松的方法，建立腎陽虛模型，造模后與生理鹽水組比較，腎陽虛各濃度組大鼠出現形體消瘦，體毛稀疏、脫毛，拱背，蜷曲，肢尾冷、擠臥在一起，肛溫降低等表現，符合中醫陽虛證的臨床表現[9]。其后分別采用MTT法、流式細胞術及熒光染色觀察腎陽虛證制首烏含藥血清對L02肝細胞增殖及凋亡狀態的影響。MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。
FCM是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，與傳統的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優點，成為當代最先進的細胞定量分析技術。細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外，而Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對PS有高度的親和性，可充當檢測PS的敏感探針。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發生在細胞壞死中，碘化丙啶(PI)則能透過凋亡中晚期的細胞核死細胞并使細胞核染紅。因此，本文采用Annexin V結合PI染料以檢測區分不同凋亡時期的細胞。
本實驗結果顯示，15%腎陽虛各濃度組含藥血清作用24h及48h后，均對L02肝細胞增殖有一定的抑制作用，腎陽虛高濃度組含藥血清作用48h后細胞抑制率達24.92%。腎陽虛中、高濃度組的細胞凋亡率明顯升高，分別為27.54%和30.75%。Annexin V-FITC/PI熒光染色結果也顯示，腎陽虛中、高濃度組出現早期凋亡及晚期凋亡的細胞明顯增多。實驗結果顯示，制首烏腎陽虛含藥血清作用于肝細胞后，肝細胞增殖的抑制率及肝細胞凋亡率均出現顯著性增高，且呈劑量相關性，提示腎陽虛證為制首烏致肝損傷的靶向證候。本研究為臨床上正確使用制首烏，避免不良反應的出現提供了依據，制首烏為傳統的滋補腎陰的代表性藥物，在臨床應用時應辨證施治，避免應用于腎陽虛證候藥不對證的情況出現。
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