PCR自我鑒定

PCR自我鑒定

　　篇一：PCR個人經(jīng)驗總結(jié)

　　PCR經(jīng)驗總結(jié)

　　1. primers design

　　這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件

　　a 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量。

　　b GC% 40%-60%

　　c 5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性

　　d 避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER

　　f. 避免3'端的錯配

　　g. 避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)

　　h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不需要加上這些序列,但在檢測互補 和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們

　　i. 需要使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)

　　j. 最好學會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.

　　* 引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低5℃。

　　設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。 根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。

　　為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

　　2. stability of primers

　　定制引物的標準純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存 2個月。

　　3. optimize reactants concentration

　　a. magnesiom ions

　　Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用，并能影響Polymerase的活性。

　　一般 的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整。同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度。對實時定量PCR，使用3-5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液。

　　b. 其他的離子

　　NH4+ K+都會影響PCR。增加K+的濃度后, 會因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴謹性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的.當然, 過高的陽離子濃度(KCL>0.2M)時, DNA在94度根本不會發(fā)生變性, 當然也就無從談起PCR了.

　　c. polymerase

　　不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真酶的效率要遠遠低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性 d. template

　　50ul PCR SYSTEM

　　human gDNA 0.1ug-1ug

　　E.Coli 10ng-100ng

　　Lamada DNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng

　　4. temperature

　　a. denaturation

　　常規(guī)是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘，除了GC Rich外, 常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation

　　b. annealing

　　重點到了。一般情況下, 是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進行調(diào)整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時間在30-60S, 時間短一些可以得到更好的效果. 因為, polymerase 在annealing temp.時也會有一些活性. 所以在A.T.的時間過長, 會極大的增加非特異性擴增的風險.另外,在對于一些困難戶, 比如從gDNA里擴增大片段, 還可使用two step PCR.

　　5. touchdown PCR

　　原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度 94 5min—（94 30s—60 30s—72 1min）×2—（94 30s—59 30s—72 1min ）×2—（94 30s—58 30s—72 1min）×2—........—（94 30s—51 30s—72 1min）×2—（94 30s—50 30s—72 1min）×20—72 5min

　　6. hot start PCR

　　熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并

　　將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。

　　熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應(yīng)體系達到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法 過于煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，加入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。

　　ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)

　　Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)

　　Magnesium wax beads (Stratagene).

　　象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。

　　7. Booster PCR

　　我們知道1ug human genomic DNA 大約在3X105個模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合. 當模板的濃度過低,比如低于100個分子時, 引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng). 引物容易自身進行反應(yīng)形成二聚體.這樣就有來了個 booster PCR 我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster.具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的 molar ratio在107~ 108. 以確保開始擴增的準確性.然后booste Primer的濃度到正常的水平

　　8. 循環(huán)數(shù)和長度

　　確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: 產(chǎn)物能夠保證你進一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因為過多的循環(huán)數(shù)容易造 成ERRORS和非特異性產(chǎn)物的`積累、產(chǎn)物的量不夠, 優(yōu)化的方法有:

　　1. 增加TEMPLATE

　　2. 增加循環(huán)數(shù)

　　如何確定循環(huán)數(shù),有一個方法.做一個PCR體系,40循環(huán),50ul, 分別在20,25,30,35循環(huán)時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù)另一個會影響PCR特異性的是PCR cycling時在兩個溫度間變化的速率(ramping rate).當然是越高越好.不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺PCR儀,也沒有多少挑選的余地

　　9. thermal cycler

　　PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長時間的使用后需要調(diào)整PCR儀,以保證其能夠到達正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).

　　10. PCR additives

　　附加物或者說enhancer實在是多種多樣. 基本上包括幾類, 能夠增加反應(yīng)退火效率的化學因子, DNA結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑. 基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配, 增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量.在GC Rich情況中, additive可以造成配對堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-template 復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定, 而提高了擴增的忠實性.要注意的是,沒有萬能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結(jié)合gradient pcr選擇最優(yōu)條件.

　　====================================================

　　dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%

　　formamide at 5%

　　trimethylammonium chloride 10-100uM

　　detergents such as Tween 20 0.1-2.5%

　　polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%

　　glycerol 10-15%

　　single stranded DNA binding proteins

　　Gene 32 protein 1nM

　　E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM

　　7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP

　　Taq Extehder (stratagene)

　　Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)

　　Q-solution(Qiagen)

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　　要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度

　　11. Template DNA preparation

　　提取DNA時的試劑會抑制PCR反應(yīng)的順利進行.因此需要對TEMPLATE DNA進行純化.特別是SDS(<0.01%) 的情況下就能強烈抑制PCR的進行. 可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過來抑制SDS. 還有proteinase K也要除干凈, 不然會降解polymerase.

　　12. Nested PCR

　　簡單點說 設(shè)計兩對引物, 一對是長的, 一對是包含在長引物內(nèi)的, 用長引物擴增的產(chǎn)物作為第二次擴增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量. 而且可以減少非特異性帶和錯配的情況. 增加PCR的保真性

　　高保真酶

　　高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型：

　　a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強,因為他不糾正合成中出現(xiàn)的突變

　　b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase

　　c.有DNA聚合活性,沒有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比Taq DNA聚合酶低。 酶的混合物

　　將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨Taq DNA聚合酶高的忠實性，并可以得到高產(chǎn)量及擴增長模板。

　　其他因素

　　除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實性會受影響。進行較少的PCR循環(huán)也會有助于增加忠實性，因為增加循環(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會增加突變可能性。

　　篇二：醫(yī)學檢驗自我鑒定范文

　　醫(yī)學檢驗自我鑒定范文

　　英語水平：具有一定的英語聽說讀寫能力

　　計算機水平：國家計算機一級

　　普通話水平：國家二級

　　學習經(jīng)歷：xx年8月至xx年7月 尉氏三中

　　xx年9月至xx年7月 山東聊城職業(yè)技術(shù)學院

　　實習經(jīng)歷：xx年8月至xx年1月在開封市第一人民醫(yī)院檢驗科，輸血科實習

　　xx年2月至今在開封市淮河醫(yī)院檢驗科實習

　　興趣特長：對專業(yè)理論知識掌握牢固并能熟練應(yīng)用，對臨檢室，生化室，免疫室，細胞室等操作熟練。

　　擅長乒乓球，喜歡舞蹈，音樂

　　自我評價：極有耐心，為人誠懇，樂于助人，積極向上，有較強的團隊意識和學習能力，業(yè)務(wù)知識熟練，社會適應(yīng)能力強，多才多藝

　　求職意向：與檢驗相關(guān)職業(yè)

　　醫(yī)學檢驗個人自我鑒定范文(三)

　　本人在校期間認真完成了本科階段的專業(yè)知識，涉獵了許多醫(yī)學書刊及文獻，熟練的掌握了基礎(chǔ)理論知識及操作技術(shù)，有很強的責任心和敬業(yè)精神，專業(yè)知識過硬，有旺盛的求知欲，廣泛愛好，時間觀念強;嚴于自律，吃苦耐勞;團隊親和力強，有較強的環(huán)境適應(yīng)能力。 具有兩年實習經(jīng)歷的我積累了很多的臨床經(jīng)驗，熟悉和掌握了各科常見疾病的診療常規(guī)及治療原則，能夠正規(guī)全面系統(tǒng)的進行體格檢查、及時完成醫(yī)療文件書寫，了解常用藥物的劑量及用法;多次參加危重癥患者的搶救，進行了專業(yè)的“三基”培訓，實習期間可獨立完成檢驗任務(wù)，能夠與帶教老師達成共識，得到了醫(yī)院領(lǐng)導及老師的肯定。可熟練完成臨床檢驗的基本操作等。所以我希望找一份與自身知識結(jié)構(gòu)相關(guān)的工作，如醫(yī)學檢驗技術(shù)可以有更大的空間來證明自己，發(fā)展自己!

　　醫(yī)學檢驗專業(yè)個人簡歷自我鑒定范文(四)

　　本人曾在校社團聯(lián)合會網(wǎng)絡(luò)信息部和檢驗學院學生會工作，并擔任班干部;在校期間，組織策劃了“廣東醫(yī)學院首屆電子賀卡設(shè)計大賽”和“廣東醫(yī)學院首屆電子競技大賽”;加入了檢驗學院科研小組，成功申請并參與了“高效液相色譜儀檢測兒童食品中的色素含量”。這些經(jīng)歷培養(yǎng)了我良好的領(lǐng)導、管理、協(xié)作、交際溝通和創(chuàng)新能力，使我能客觀理智地面對問題，顧全大局，對凡事持尋求解決的態(tài)度。

　　一年的實習工作更是豐富了我的閱歷，培養(yǎng)了我開拓創(chuàng)新的思維和解決問題的能力，更加系統(tǒng)地掌握了臨床各項檢測的基礎(chǔ)理論和基礎(chǔ)操作技術(shù)，掌握了微生物、病毒的實驗檢驗原理和操作技術(shù)，熟悉專業(yè)儀器(如：pcr儀、酶標儀、icp儀，氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，高效液相色譜儀，熒光光譜儀等)的性能和運用，有較強的綜合分析能力和動手能力，也具有一定的科研能力。

　　我性格開朗、積極上進;具有良好的團隊精神和人際關(guān)系，對待工作認真負責、勤懇耐勞，耐心細心，在工作中善于到激勵他人的作用，同時善于并熱愛與人溝通交流;敢于開拓創(chuàng)新，有著強烈的事業(yè)心與責任感，對人生和事業(yè)充滿熱情和憧憬。

　　醫(yī)學檢驗畢業(yè)生個人簡歷自我鑒定范文(五)

　　我于xx年9月經(jīng)過普通高考考入南方醫(yī)科大學(原第一軍醫(yī)大學)，本人性格開朗、穩(wěn)重、有活力，待人熱情、真誠。工作認真負責，積極主動，能吃苦耐勞。有較強的組織能力、實際

　　動手能力和團體協(xié)作精神，能迅速的適應(yīng)各種環(huán)境，并融合其中。認真的學習態(tài)度和對本專業(yè)的濃厚的興趣，讓我在各方面都表現(xiàn)出色。

　　從大一開始，我就特別注重在認真學習好理論課的同時，努力培養(yǎng)自身的綜合素質(zhì)，為學好專業(yè)課打下了良好的基矗從理論轉(zhuǎn)為專業(yè), 我熱愛我的專業(yè)并為之投入了巨大的熱情和精力，充分利用課余時間，拓寬知識視野，完善知識結(jié)構(gòu)。通過閱讀大量的課外相關(guān)書籍來充實自己的專業(yè)知識。在競爭日益激烈的今天，我堅信只有多層次，全方位, 高要求的發(fā)展，并熟練掌握專業(yè)知識的人才，才符合社會發(fā)展的需要, 才符合用人單位的需求，才符合自身發(fā)展的要求。

　　在校期間，我還積極參加學院. 大學生運動會等多項大型活動，培養(yǎng)了我的交際能力，使我懂得了如何與人和睦相處。多年的軍校生活造就了我不怕苦不怕累的態(tài)度, 使我處事更務(wù)實、更有責任感。實習期間我嚴格遵守醫(yī)院的各項制度, 積累了豐富的工作經(jīng)驗，和完善的專業(yè)技能. 這一切都是我不懈努力的結(jié)果，也是我所具有積極進取精神的體現(xiàn)。相信這將是我今后的工作的重要經(jīng)驗和寶貴財富。

　　深厚的專業(yè)知識，完整的知識結(jié)構(gòu)，豐富的實踐經(jīng)驗，樂觀豁達的性格，嚴謹?shù)能娦Ｉ��? 超強的團體協(xié)作精神和親和力，定會助我在曲折中順利完成各項工作任務(wù)。

　　愿貴醫(yī)院給我一次嘗試施展自己潛能的機會，我會盡心盡責，盡我所能，讓貴醫(yī)院滿意，讓患者滿意!

　　篇三：菌落PCR鑒定

　　（六）菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子

　　1. PCR mix的制備

　　Taq buffer（10×） 20 μL

　　(轉(zhuǎn) 載于:wWw.cnboThwiN.cOM 博 威范文 網(wǎng):pcr室自我鑒定)

　　dNTP（2.5 mmol/L）5 μL

　　Primer Forward（50 mmol/L） 10 μL

　　Primer Reverse（50 mmol/L） 10 μL

　　ddH2O 147 μL

　　Taq（2U/μL） 8 μL

　　total 200 μL

　　將上述溶液混勻，10 μL每管分裝于200 μL PCR管中。

　　2. 常溫下隨機挑選轉(zhuǎn)化板上的轉(zhuǎn)化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取少量菌體，在LB瓊脂糖平板上輕點，做一拷貝；然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應(yīng)的裝有PCR混合物的PCR管中洗滌數(shù)下（管子做好記號，將平板上點的克隆標號與管子上的對應(yīng)起來，以便篩選到克隆后進行擴繁培養(yǎng)），蓋緊管子。

　　3. 將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按常規(guī)條件擴增。PCR反應(yīng)程序根據(jù)具體的引物設(shè)置，參考下列程序：

　　95℃，3 min

　　95℃，30 s 56℃，30 s 72℃，50 s 30個循環(huán)

　　72℃，10 min。

　　4. 電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽性克隆。（取5 μL PCR反應(yīng)液與1 μL上樣緩沖液混合，進行1% 瓊脂糖電泳，5V/cm，選擇適當大小的DNA分子量標準，檢查擴增產(chǎn)物。紫外觀察PCR產(chǎn)物是否與插入片段大小一致？）

　　5. 將已經(jīng)接種有菌落的平板置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，使菌落擴增；次日挑選陽性克隆做進一步篩選或培養(yǎng)。步驟2也可以不點板，直接接種搖菌，盡可能安排在早上做PCR，下午就可以提質(zhì)粒，得到重組載體。

　　（七）菌液PCR鑒定轉(zhuǎn)化子

　　1. 取培養(yǎng)過夜的轉(zhuǎn)化菌液20 μL，沸水浴3～5 min。

　　2. 室溫12 000r/min 離心2min。取上清液作為PCR的摸板，按下列反應(yīng)體系配制

　　ddH2O 13.5 μL

　　10×PCR Buffer（25mM Mg離子） 2 μL

　　dNTP（10mM each） 0.5 μL

　　Primer l（20μM） 0.5 μL

　　Primer 2（20μM） 0.5 μL

　　模板DNA2 μL

　　TaqDNA聚合酶（2.5U）1 μL

　　總體積20 μL

　　3. 加一滴液體石蠟，混勻，短暫離心。

　　4. 在PCR儀上進行PCR反應(yīng)。參考下列程序：

　　95℃，3 min

　　95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，50 s，30個循環(huán)

　　72℃，10 min。

　　5. 電泳檢測是否得到目的片斷。

　　1 最簡單的：用槍尖或者牙簽從平板或液體中沾少量菌（多了就會影響反應(yīng)了，沾上點就夠了），直接加入到PCR體系中反應(yīng)就行了，依靠變性溫度來破裂細菌釋放DNA，我一直這樣做大量篩選。

　　2 旁邊實驗室的方法：用槍尖或者牙簽沾少量菌，加入到?jīng)]有加酶的PCR反應(yīng)體系中，沸水浴5min，冷卻后加入酶，開始反應(yīng)，有些不容易加熱破裂的菌預(yù)先煮沸一下，可以釋放更多的DNA，有利于PCR反應(yīng)。

　　3 用Chelex，旁邊的旁邊的實驗室做菌種鑒定的時候習慣用的方法：可以去除一部分雜質(zhì)，降低PCR反應(yīng)所受的干擾。

　　1) 5%-10%chelex 50μl(配法：5-10g chelex 加入100ml TE)+菌苔，在管壁適當研磨，震蕩混勻，短暫離心

　　2) 煮沸：細菌5min，放線菌10-15min

　　3) 冷卻至室溫，10000-12000rpm離心5-8min，取上清擴增

　　注：chelex方法適于細菌、放線菌，chelex提前在65攝氏度水浴中預(yù)熱，溶液有細小顆粒，吸取時槍尖最好先剪掉，否則不好吸。

　　這3個方法由簡到繁，效果當然是依次提高了。我理解，這樣的直接以細菌為模板進行PCR反應(yīng)，特別是前兩種，適用于大量的篩選和驗證，由于加入了細菌本身的其他物質(zhì)以及難免引入的培養(yǎng)基成分，可能會對PCR反應(yīng)造成干擾，假陽性假陰性都是可能出現(xiàn)的，所以之后最好還要進一步驗證。chelex方法可以去除一定的雜質(zhì)，干擾較小，但是畢竟也不如直接以DNA為模板效果好。樓主需要根據(jù)自己的實際需要來選擇合適的方法。

　　把PCR MIX加好，最好把細菌用TIP沾點就可以了。變性溫度也不變，時間可長點兒，容易。

　　我也這樣做過，96度變性時延長為10min左右，幾乎都能擴增出來。

　　但鑒于我做的是革蘭氏陰性菌，對于陽性球菌，還真不好說。

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