熒光素酶基因原理報(bào)告

時(shí)間：2024-08-31 07:40:28

熒光素酶基因原理報(bào)告

熒光素酶基因原理報(bào)告

熒光素酶基因原理報(bào)告

　　Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢

　　火蟲(chóng)熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過(guò)熒光測(cè)定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測(cè)定儀測(cè)定luciferin氧化過(guò)程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)。是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法。

　　雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試∶ 結(jié)合螢火蟲(chóng)和海洋腔腸熒光素酶先進(jìn)的共報(bào)告基測(cè)試技術(shù)在用螢火蟲(chóng)熒光素酶定量基因表達(dá)時(shí), 通常采用第二個(gè)報(bào)告基因來(lái)減少實(shí)驗(yàn)的變化因素。但傳統(tǒng)的共報(bào)告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不夠便利,因?yàn)楦髯缘臏y(cè)試化學(xué),處理要求檢測(cè)特點(diǎn)存在差異。

　　Promega提供一種先進(jìn)的雙報(bào)告基因技術(shù),結(jié)合了螢火蟲(chóng)熒光素酶測(cè)試和海洋腔腸熒光素酶測(cè)試。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng),結(jié)合pRL 載體系統(tǒng),表達(dá)第二個(gè)報(bào)告基因海洋腔腸熒光素酶,在單管中進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試,快速,靈敏,簡(jiǎn)便。系統(tǒng)還提供 PLB裂解液,用來(lái)裂解在多孔板中培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞,不需操作單個(gè)樣品。對(duì)于正在使用螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體的研究人員。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)將使他們體會(huì)到該系統(tǒng)的便利。

　　應(yīng)用原理

　　轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（luciferaseAssay）是檢測(cè)這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段。

　　其原理簡(jiǎn)述如下：

　　（1）構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。

　　（2）將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。

　　（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光素，通過(guò)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。

　　工作流程

　　（1）用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

　　（2）設(shè)計(jì)引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段，將此片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pGL3-basic）中。

　　（3）篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。

　　（4）擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時(shí)準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對(duì)照，提純備用。

　　（5）培養(yǎng)293（或其它目的細(xì)胞），并接種于24孔板中，生長(zhǎng)10-24小時(shí)（80%匯合度）。

　　（6）將報(bào)告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

　　（7）提取蛋白并用于熒光素酶檢測(cè)。

　　（8）加入底物，測(cè)定熒光素酶的活性。

　　（9）計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度，并與空載對(duì)照比較。

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